Je connaissais la ville par ce que m’en avaient dit mon frère, d’abord, puis ma mère, évidemment.

Le sujet est bien mon frère et ma mère, soit deux singuliers qui forment un pluriel. « ma mère » n’est pas en incise.
Dans votre phrase, le fait que vous mettiez deux virgules n’annule pas l’addition des deux sujets. D’ailleurs, il me semble que « d’abord » est redondant car vous pouvez écrire …. »mon frère, puis ma mère, évidemment ».
Une incise est un groupe de mots entre deux virgules ; c’est une proposition, généralement courte, insérée dans une autre proposition : Un jour, je pense, il reviendra.

Ce qui permettrait de laisser le singulier c’est la phrase suivante :
Ma mère, comme mon frère, connaît la ville. ==> »comme mon frère » est une incise mais c’est un complément qui ne crée pas un sujet au pluriel.
Dernier point :
Ma mère comme mon frère connaissent la ville. Pas de virgule, mais une addition.

Merci beaucoup ! C’est très clair.
(En effet, « d’abord » n’est pas forcément nécessaire. )